Cíl studie: Plynová chromatografie se v diagnostice užívá pro speciální stanovení, například profilu organických kyselin v moči nebo séru. Tato metoda ovšem umožňuje, zejména pak ve svém dvojdimenzionálním uspořádání (GC×GC), mnohem ucelenější pohled na vybraný biologický materiál. Cílem práce bylo vyvinout postup pro komplexní analýzu biologického materiálu. Typ studie: Vývoj analytické metody Název a sídlo pracoviště: Laboratoř dědičných metabolických poruch, Fakultní nemocnice, Olomouc Materiál a metody: Analýzy byly provedeny na GC×GC (Agilent 7890) spojeném s průletovým hmotnostním analyzátorem (TOF MS) (LECO Pegasus 4D). Automatické zpracování dat bylo provedeno programem ChromaTOF (LECO) za použití „reference.“ Výsledky: V této studii byla vytvořena tzv. reference metabolitů, obsahující zejména organické kyseliny, aminokyseliny a látky podobné povahy, které byly derivatizovány dvěma postupy – silylací nebo alkylací methylchloroformiátem. Aplikací reference na naměřené vzorky bylo možno identifikovat (shoda 733–999) více než 100 analytů v každém vzorku. Závěry: GC×GC-TOF je vhodná metoda pro metabolomickou analýzu mnoha biologických matricí a může být také uplatněna v diagnostice metabolických onemocnění. Zpracování dat lze plně automatizovat., Objective: Gas chromatography is used in diagnostics mostly for special analyses e.g. organic acids profiling in urine or serum. But this method enables, especially in two-dimensional version (GC×GC), more comprehensive view on selected biological material. The aim of this work was to develop a method for complex analysis of biological material. Design: Analytical method development Settings: Laboratory for Inherited Metabolic Disorders, Palacky University and University Hospital, Olomouc Material and methods: Analyses were performed on GC×GC (Agilent 7890) coupled with time-of-flight mass analyzer (TOF MS) (LECO Pegasus 4D). An automated data processing was performed by the ChromaTOF software (LECO) using “reference” tool. Results: In this study, the list of metabolites was created. It covers predominantly organic acids, amino acids, sugars, and similar – silylated or alkylated via methylchloroformiate. After applying the reference we were able to identify (spectral matches of 733–999) more than 100 analytes in each sample. Conclusion: GC×GC-TOF is a valuable tool in metabolomic analysis of many biological matrices and enables also diagnosing metabolic disorders. Data processing can be fully automated., Wojtowicz P., Dostálová E., Adam T., and Literatura 2
Cíl studie: Analýza erytrocytárních nukleotidů je využívána k diagnostice defektů záchranných cest purinového metabolismu. Cílem této práce je objasnit, zda je toto vyšetření použitelné také v diagnostice defektů druhé poloviny purinové de novo syntézy (PDNS). Ke studiu membránového transportu a následné biotransformace byly použity defosforylované meziprodukty druhé poloviny PDNS. Materiál a metody: Patofyziologická situace u pacientů trpících deficity PDNS byla simulována inkubací nativních erytrocytů, erytrocytárních membrán a lyzovaných erytrocytů s defosforylovanými meziprodukty druhé poloviny PDNS: 5-aminoimidazolribosid (AIr), 5-amino-4-imidazolkarboxribosid (CAIr), 5-amino-4-imidazolsukcinokarboxamidribosid (SAICAr), 5-formamido-4-karboxamidribosid (FAICAr) a 5-amino-4-imidazolkarboxamidribosid (AICAr). Tyto sloučeniny byly chemicky syntetizovány a použity jako standardní látky. Inkubační směsi byly analyzovány pomocí kapilární elektroforézy s UV detekcí pomocí tří separačních systémů, které dovolují analyzovat ribosidy i ribotidy. Výsledky: Jen dva ze studovaných ribosidů (AICAr, FAICAr) prostoupily membránou erytrocytu v detekovatelném množství. Pouze AICAr je vhodným substrátem erytrocytárních kináz a je konvertován na odpovídající mono-, di- a trifosfáty. Závěr: Výsledky ukazují, že analýza erytrocytů je použitelná pouze pro diagnostiku defektu bifunkčního enzymu AICAR- -transformylázy/IMP-cyklohydrolázy., Objective: Analysis of erythrocyte nucleotides is useful for diagnosing defects in purine salvage pathways. The aim of this work was to elucidate whether the investigation could be used in diagnosing defects of a second part purine de novo synthesis (PDNS). Dephosphorylated intermediates of the second part of PDNS (aminoimidazoleribosides) were used for membrane transport and biotransformation study. Material and Methods: Pathophysiological situation in patients suffering from defects of PDNS was simulated by incubation of native erythrocytes, erythrocyte membranes and erythrocyte lysates with dephosphorylated intermediates of second part of PDNS: 5-amino-4-imidazoleriboside (AIr), 5-amino-4-imidazolecarboxyriboside (CAIr), 5-amino-4- -imidazolesuccinocarboxamideriboside (SAICAr), 5-formylamino-4-imidazolecarboxamideriboside (FAICAr) a 5-amino- -4-imidazolecarboxamideriboside (AICAr). The compounds were synthesized and taken as standard compounds. Incubation mixtures were analyzed by capillary electrophoresis using three separation systems allowing analysis of both ribosides and ribotides. Results: Two of all studied ribosides (AICAr a FAICAr) were able to permeate through the erythrocyte membrane in detectable amounts. AICAr is an acceptable substrate for erythrocyte kinases and is converted to mono-, di- and triphosphates. Conclusions: The results suggest that erythrocytes are only useful for diagnosing AICAR-transformylase/IMPcyclohydrolase deficiency., Petra Vyskočilová, Hana Kuchyňová, Lenka Opluštilová, David Friedecký, Petr Horník, Kateřina Adamová, Tomáš Adam, and Lit.: 7
Cíl: V současné době byly identifikovány tři defekty v purinové de novo syntéze (PDNS). V případě deficitních enzymů jsou v tělních tekutinách pacientů akumulovány abnormální defosforylované substráty (aminoimidazolové ribosidy). Cílem této práce bylo studovat hmotově-spektrometrické vlastnosti aminoimidazolových ribosidů spojených s druhou polovinou PDNS. Metody: Aminoimidazolové ribosidy byly syntetizovány a chemicky charakterizovány. Technika kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrií byla aplikována pro strukturní identifikaci. MS analýza byla provedena na LCQ hmotnostním spektrometru s iontovou pastí (Finnigan MAT, San Jose, USA). Pro ionizaci byla zvolena chemická ionizace za atmosferického tlaku. Výsledky: Účinnost syntézy ribosidů byla více než 90% a obdržená fragmentační spektra potvrdila jejich identitu. Při fragmentaci ztrácí imidazolový kruh substituenty ve formě malých molekul (NH3, CO2 nebo CO). Sukcinylaminoimidazol karboxamid ribosidu (SAICAr) odštěpuje buď N-sukcinokarboxamid jako celek, nebo se z něj pouze odštěpují skupiny vody z karboxylových skupin. Otevření imidazolového kruhu nebylo sledováno u žádné látky. Závěr: Výše popsaná charakteristika může být užitečná pro vývoj nových metod pro diagnostiku známých či zatím neodhalených defektů druhé poloviny PDNS., Objectives: Three defects have been identified in purine de novo synthesis (PDNS). Dephosphorylated substrates (imidazole ribosides) of the deficient enzymes are accumulated in body fluids in affected patients. The aim of this work was to investigate mass spectrometric properties of aminoimidazole ribosides related to the second half of PDNS. Methods: These aminoimidazole ribosides were synthesised and chemically characterised. Liquid chromatography- -mass spectrometry technique was applied for structural identification. MS analysis was carried out using an LCQ ion trap mass spectrometer (Finnigan MAT, San Jose, USA). Atmospheric pressure chemical ionization source was employed. Results: Synthesis yielded ribosides with more than 90% purity and obtained fragmentation spectra confirmed their identity. The imidazole ring loses its substituents in the form of small molecules (NH3, CO2 or CO) in mass spectrometry fragmentation. The N-succinocarboxamide group of succinylaminoimidazole carboxamide riboside (SAICAr) either loses water from the free carboxyl groups or breaks away as a whole. Opening of the imidazole ring was not observed for any compound. Conclusions: Characteristics described above can be useful for development of new methods for diagnosing of known as well as unrevealed defects of second part of PDNS., David Friedecký, Petra Vyskočilová, Petr Fryčák, Petr Hornik, Karel Lemr, Tomáš Adam, and Lit.: 5
Cíl studie: Metabolomika se stává důležitým nástrojem v klinickém výzkumu a diagnostice lidských onemocnění. V této studii byla použita necílená metabolomická analýza suchých krevních skvrn (DBS) pro diagnostiku dědičných metabolických poruch (DMP). Typ studie: Klinická aplikace Materiál a metody: Vzorky DBS byly analyzovány technikou vysoce účinné kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostním spektrometrem s vysokým rozlišením. Data byla zpracována a statisticky vyhodnocena s použitím softwaru R. Výsledky: Bylo porovnáváno 20 kontrolních vzorků vůči třem vzorkům od pacientů s fenylketonurií a třem vzorkům od pacientů s leucinózou. Všechny pacientské vzorky se podařilo rozlišit od kontrolních na základě příslušných markerů jednotlivých onemocnění. Závěry: Tato studie ukazuje, že necílená metabolomika může být uplatněna při diagnostice DMP., Objective: Metabolomics has become an important tool in clinical research and diagnosis of human diseases. In this work we applied untargeted metabolomic analysis of dry blood spots (DBS) for diagnosing inherited metabolic disorders (IMDs). Design: Clinical application Material and methods: DBS samples were analyzed by high performance liquid chromatography coupled with high-resolution mass spectrometer. Data were processed and statistically evaluated using R software. Results: We compared 20 control samples with three samples from patients with phenylketonuria and three samples from patients with maple syrup urine disease. All patient samples were distinguished from controls based on appropriate markers of the disorders. Conclusion: This study shows that untargeted metabolomics can be applied for diagnosing various IMDs., Janečková H., Wojtowicz P., Hron K., Friedecký D., Adam T., and Literatura 5
Cíle studie: Cílem této studie je sledování vzájemného vztahu plasmatických hladin imatinibu s jeho denní dávkou a časovým intervalem od poslední užité dávky u pacientů s chronickou myeloidní leukemií na terapii imatinibem. Chronická myeloidní leukemie (CML) je myeloproliferativní onemocnění charakteristické přítomností chromozomu Philadelphia a leukemického fúzního genu BCR-ABL vedoucího k expresi konstitutivně aktivní tyrosinkinázy zodpovědné za maligní transformaci. Největší úspěšnost v léčbě byla zaznamenána prostřednictvím cílených inhibitorů vzniklého onkoproteinu, proto je dnes imatinib používán jako lék první linie. Terapeutické monitorování plasmatických hladin imatinibu u pacientů s CML je důležitým nástrojem k optimalizaci a individualizaci léčby. Typ studie: Klinická Materiál a metody: V naší studii jsme analyzovali soubor 1790 vzorků od 168 pacientů s CML na terapii imatinibem. Veškerá měření byla provedena metodou kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií v rámci rutinního vyšetřování plasmatických hladin tyrosinkinázových inhibitorů. Denní dávka imatinibu s pohybovala v rozmezí 100 až 800 mg; vzorky byly odebrány 1–120 hodin od poslední užité dávky. Výsledky a závěr: Analýza výsledků odhalila významnou korelaci plasmatické hladiny imatinibu s jeho denní dávkou (R2 = 0,075) a časovým intervalem od poslední užité dávky (R2 = 0,177). Z celého souboru bylo vybráno 616 vzorků odebraných 24±4 hodiny od poslední dávky od 111 pacientů s denní dávkou 400 mg imatinibu a byla stanovena inter- (48 %) a intraindividuální (36 %) variabilita., Objective: The aim of the study is monitoring of correlation of imatinib plasma levels with daily dose and sampling time in patients with chronic myeloid leukemia on imatinib therapy. Chronic myeloid leukemia (CML) is myeloproliferative disorder characterized by the presence of chromozome Philadelphia and leukemic fusion gene BCR-ABL leading expression of constitutively active tyrosin kinase responsible for malignant transformation. The most successful treatment was recorded via targeted inhibitors of generated oncoprotein and therefore imatinib is used as a first-line treatment, today. Therapeutic monitoring of imatinib plasma levels in patients with chronic myeloid leukemia is important tool for treatment individualization. Design: Clinical Materials and methods: In our study we have analyzed a group of 1790 samples from 168 patients with CML on imatinib therapy. All measurements were performed by the liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry method within routine monitoring of plasmatic levels of tyrosin kinase inhibitors. Imatinib daily dose vary from 100 to 800 mg and samples were obtained 1 - 120 hours after last drug administration. Results and conclusion: Analysis of the results revealed correlation between imatinib plasma level and daily dose (R2 = 0.075) or with sampling time (R2 = 0.177). From whole data file 616 samples taken 24±4 hours after last drug administration from 111 patients with imatinib daily dose 400 mg were chosen and inter- (48 %) and intraindividual (36 %) variability were determined., and Mičová K., Friedecký D., Faber E., Adam T.