Cílem studie bylo zavést HPLC metodu pro stanovení albuminurie, potvrdit či vyvrátit tvrzení, že HPLC poskytuje falešně vyšší koncentrace albuminu v moči díky interferenci s dalšími bílkovinami, porovnat koncentrace albuminu v moči stanovené HPLC a imunoturbidimetricky. Materiál a metody: Metodu HPLC jsme zavedli za následujících podmínek: složení mobilní fáze: složka A) voda, složka B) acetonitril, složka C) 100 mM NaH2PO4 a složka D) 1 % trifluoroctová kyselina; kontinuální gradient mobilní fáze; průtok mobilní fáze 2 ml/min; teplota analýzy 22 ºC; UV detekce při 280 nm; kolona Zorbax 300 SB-C3, kapalinový chromatograf Agilent 1200 (Agilent Technologies, USA). Analyzovali jsme 2 směsné moči. Do směsi 1 připravené ze vzorků 30 imunoturbidimetricky negativních močí byl přidán standard albuminu. Směs 2 byla připravena z 30 imunoturbidimetricky „mikroalbuminurických“ vzorků. Soubor tvořilo 301 pacientů (161 diabetiků a 140 nediabetiků, 182 mužů a 119 žen, věk 44,1 ± 25,3 let). Výsledky: Za uvedených analytických podmínek transferin, α-1-kyselý glykoprotein, α-1-antitrypsin, α-1-antichymotrypsin a hemopexin neinterferují s albuminem, zatímco eluční křivka prealbuminu se štěpí na několik píků, z nichž některé z nich s albuminem koeluují. Vzhledem k nízkým sérovým i močovým koncentracím prealbuminu lze usuzovat, že je tato interference klinicky nevýznamná. Ve směsi 1 jsme nezaznamenali významný rozdíl v hodnotách albuminurie mezi metodami (79,1 mg/l imunoturbidimetricky vs. 82,5 mg/l HPLC), oproti tomu, ve směsi 2 byla HPLC zjištěná hodnota o 26 % vyšší (79,5 mg/l imunoturbidimetricky vs. 99,9 mg/l HPLC). Tyto výsledky nasvědčují na existenci imunonereaktivního albuminu. Zjistili jsme statisticky významný rozdíl mezi metodami v případě pacientských vzorků moči (soubor všech pacientů [medián ± SEM]: 21,1 ± 38,2 mg/l imunoturbidimetricky vs. 30,4 ± 42,2 mg/l HPLC, p < 0,0001, Mann-Whitneyův test), nejmarkantnější u imunoturbidimetricky „normoalbuminurických“ diabetiků. Závěr: Naše výsledky svědčí pro vyšší senzitivitu HPLC metody pro zachycení „mikroalbuminurie“ (ve srovnání s imunoturbidimetrií). Uvedená HPLC metoda je dostatečně specifická pro stanovení albuminu v moči, nedochází k významným interferencím s dalšími bílkovinami., Objective: The aim of our study was the implementation of HPLC method for assessing albuminuria, confirming or refusing the hypothesis about the existence of co-eluting proteins, and comparison of urine albumin concentrations assessed using HPLC and immunoturbidimetric methods in patient samples. Material and Methods: We developed the HPLC method under these chromatographic conditions: multilinear gradient of mobile phase consisting of water (solvent A), acetonitrile (solvent B), 100 mM NaH2PO4 (solvent C), 1 % trifluoroacetic acid (solvent D), flow rate 2 mL/min, temperature 22 ˚C, UV detection in the wavelength 280 nm, chromatographic column Zorbax 300 SB-C3, liquid chromatograph Agilent 1200 (Agilent Technologies, USA). We analyzed two mixtures of urine. The first one was prepared from 30 patient urine samples with immunoturbidimetrically physiological albuminuria, to which we added albumin standard. The second mixture was prepared from 30 patient urine samples with mild albuminuria. We analyzed and compared albuminuria in a group of 301 patients (161 diabetics and 140 nondiabetics, 182 males and 119 females, age 44.1 ± 25.3 years). Results: Transferrin, α-1-acid glycoprotein, α-1-antitrypsin, α-1-antichymotrypsin and hemopexin do not interfere with albumin in the presented HPLC method, whereas the elution curve of prealbumin splits into several peaks, of which a few interfere with albumin. With regard to very low prealbumin concentrations in serum and in urine, we can assume that this interference is not of clinical importance. In mixture 1 we did not find a significant difference between the albuminuria assessed using both methods (79.1 mg/L immunoturbidimetrically vs. 82.5 mg/L HPLC), while in mixture 2 we measured over 26 % greater albuminuria using HPLC (79.5 mg/L immunoturbidimetrically vs. 99.9 mg/L HPLC). These results suggest that immunounreactive albumin really exists. We found a statistically significant difference between the methods in patient urine samples (entire patients´ group: [median ± SEM]: 21.1 ± 38.2 mg/L immunoturbidimetrically vs. 30.4 ± 42.2 mg/L HPLC, p < 0.0001, Mann-Whitney test), which was most remarkable in the group of diabetic patients with immunoturbidimetrically physiological albuminuria. Conclusion: Our results prove that the HPLC method for albumin detection is more sensitive than immunoturbidimetry and sufficiently specific and there are no significant interferences with other proteins., and Fořtová M., Klapková E., Průša R.
Cíl studie: Měření koncentrací albuminu a imunoglobulinů v likvoru a v séru slouží v likvorové diagnostice k výpočtu intrathékální syntézy imunoglobulinů. Předpokládá se, že hodnotu kvocientu, tj. poměru koncentrací daného proteinu v likvoru a v séru, lze považovat za nezávislou na použité metodě, pokud je párový vzorek likvoru a séra analyzován současně na jedné (likvorové) kalibrační křivce. Pozorované diskrepance mezi likvorovými (ale nikoliv sérovými) koncentracemi IgM stanovenými nefelometricky na analyzátoru Immage a home-made sendvičovou ELISA metodou nás vedly k provedení rozsáhlejší studie srovnávající různé metody stanovení IgM v likvoru a séru. Typ studie: Porovnání výsledků různých metod používaných pro kvantifikaci IgM v likvoru. Materiál a metody: Byly srovnány výsledky stanovení koncentrací IgM získané na nefelometrech Immage, Immage 800, BN II, BN ProSpec a metodou ELISA. Vedle likvorových a sérových koncentrací byly srovnány i kvocienty likvor/sérum a výsledek výpočtu intrathékální syntézy podle Reiberova vztahu. Výsledky byly vyhodnoceny metodami Passing-Bablokovy regrese a grafu dle Blanda a Altmana s využitím statistického programu MedCalc. Výsledky: Zjistili jsme výrazné rozdíly v likvorových koncentracích IgM stanovených nefelometricky na analyzátorech Immage oproti nefelometrickému stanovení na analyzátorech řady BN a „home-made“ sendvičové ELISA metodě, které poskytly významně nižší hodnoty. Hodnoty získané ELISA metodou byly v dobré shodě s hodnotami získanými na analyzátorech řady BN. Sérové koncentrace IgM byly poněkud vyšší při použití ELISA metody. Nebyl zjištěn významný rozdíl mezi hodnotami sérových koncentrací a kvocientů likvor/sérum získanými analýzou séra na likvorové versus sérové kalibrační křivce. Hodnoty kvocientu likvor/sérum byly významně vyšší v případě stanovení na analyzátorech Immage oproti hodnotám získaným analýzou na nefelometrech řady BN i ELISA metodou. V důsledku toho byla z dat získaných na analyzátorech Immage vypočtena intrathékální syntéza IgM u 13 ze 71 vzorků, u kterých nebyla zjištěna z dat získaných na analyzátoru BN ProSpec ani ELISA metodou; u 8 z nich bylo možno považovat vypočtenou intrathékální syntézu za klinicky významnou (intrathékální frakce >10 %). Závěr: Kvocient likvor/sérum je pro IgM jednoznačně závislý na použité metodě stanovení a v některých případech může dojít i k rozdílnému hodnocení přítomnosti intrathékální syntézy IgM. Dokud se nepodaří příčinu tak výrazně odlišných výsledků koncentrace IgM v likvoru objasnit a odstranit, je žádoucí při měření na analyzátoru Immage hodnotit vypočtenou intrathékální syntézu IgM velmi opatrně a v kontextu celého likvorového nálezu. ELISA metoda je finančně nenákladná, vyžaduje minimální množství vzorku a jeví se jako jediná schopná kvantifikovat IgM prakticky v každém vzorku. Její použití v rutinní praxi je však limitováno vyššími nároky na manuální zpracování, jeví se však jako výhodná metoda minimálně pro experimentální studie, např. sledování rozložení likvorových koncentrací IgM v populaci., Objective: Quantitation of albumin and immunoglobulins in CSF and serum serves the purpose of calculation of intrathecal immunoglobulin synthesis. Quotient, i.e., concentration ratio of particular protein in CSF and serum, is assumed to be method-independent value, provided that paired CSF and serum sample is analyzed in parallel using one (CSF) calibration curve. We have observed that CSF (but not serum) IgM concentrations determined by nephelometry on Immage analyzer and by home-made sandwich ELISA were largely discrepant. This has lead us to perform a larger study comparing various methods of IgM determination in CSF and serum. Design: Comparison of various methods used for IgM quantitation in cerebrospinal fluid. Materials and Methods: Results of IgM determination on nephelometers Immage, Immage 800, BN II, and BN ProSpec, as well as by ELISA method, have been compared. Beside CSF and serum values, CSF/serum quotients and results of calculated intrathecal IgM synthesis according to Reiber´s formula have been compared. Results have been evaluated by means of Passing-Bablok regression and Bland and Altman plots, using MedCalc software. Results: We have found significant differences between CSF IgM concentrations determined by rate nephelometry on Immage analyzers and end-point nephelometry on BN analyzers or ELISA, the latter two giving significantly lower values. CSF IgM concentrations determined by ELISA were in good agreement with those determined on BN analyzers. Serum IgM concentrations were slightly higher using ELISA than using either nephelometric system. We have found no significant difference in either serum IgM or CSF/serum IgM quotient between serum analysis on CSF versus serum calibration curve. IgM quotient values were significantly higher using Immage analyzers than using either BN analyzers or ELISA method. As a consequence, intrathecal IgM synthesis, based on the Immage data, was calculated in 13 of 71 samples considered negative if data of BN analyzer or ELISA were used; in 8 of these samples, intrathecal IgM synthesis could be considered as clinically significant (intrathecal fraction > 10 %). Conclusions: CSF/serum IgM quotient is far from to be method-independent; in some cases, discrepant conclusion regarding the presence of intrathecal IgM synthesis can be obtained. Until the cause of this discrepancy is found and removed, the presence of intrathecal IgM synthesis should be judged very carefully and in the context of other CSF findings when using the Immage analyzer for measurement. ELISA method is inexpensive, requires very low amount of the sample, and is the only method able to quantify IgM in almost every CSF sample. Its use in routine practice is, however, limited by higher requirements for manual work. Nevertheless, it should be used at least in experimental studies, i.e. for the purpose of the determination of distribution of CSF IgM concentration within a population., Zeman D., Kušnierová P., Gottwaldová J., Kloudová A., Lochman I., Ženková J., Švagera Z., Bartoš V., Všianský F., and Literatura 12